NGS测序基础梳理01-文库构建

本系列文章？

本系列文章共三篇，分别介绍，文库构建（Library Preparation），簇生成（ClusterGeneration），测序及测序后数据处理得到FASTQ文件（Sequencing and Data Analysis）也就是下图中的ABCD四个部分。

本文目的？

了解二代测序文库的构建步骤，文库的结构。

为何构建文库？

由于二代测序读长的限制，不可能一下将一个很长的基因序列测通，so需要先将长基因序列随机片段化成小片段，这样的话，这些片段就可以覆盖整个基因组。

文库构建步骤？

   文库构建大致步骤类似，但是各有各自独特的点，例如，RNAseq里miRNA，lncRNA，mRNA方法各有差异，具体方法以后有机会再补充。这里以Illumina的 PE文库为例，其官网流程图如下图。

文库构建详细步骤？

• DNA片段化 （Fragment DNA）

使用超声、酶或者加热的方式将DNA样品打碎成小片段，一般在300 ~ 800bp之间除非有特殊要求。

• 末端修复（End Repair）

补平片段化时导致的不平末端。

• 3' 末端加“A” （A-tailing）

3‘ 末端加A，转换为粘性末端，与adapter 互补配对，因为adapter 3‘端有一个突出的T。

• 接头连接（ ligation adaptor）

这一步有两种不同的添加策略如下图。

左边的图是直接在fragment DNA的两端直接加上full Y-adapter, adapter中已经包括了和P5/P7 oligo互补的序列, index, 以及Read1/Read2的测序引物。

右边的图是先在fragment DNA的两端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互补配对的序列以及index序列，右图策略详细图如下，分两步：

1）PE adapter添加

利用碱基互补配对的原则，加上PE adapter。PE adpater中一部分是建库PCR富集时候需要用的引物序列，另一部分是测序时需要用的引物。

2）PCR 添加 index，P5，P7

Index也称barcode，用来区分不同样本的文库，因为测序仪一个lane产生数据量若干Gb，为了最大化利用测序仪，一次上机常会进行多个样本文库混合测序，在后续分析时，Index用来区分数据是来自哪个样本。

P5，P7是与flowcell上芯片连接的碱基序列，flowcell上也存在同样的P5 P7,flowcell下文介绍。

• PCR富集目的片段

进行PCR扩增，循环数与投入的DNA量有关，使得文库达到上机浓度。

• 扩增文库大小质检

使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测。

• 文库浓度定量

Qubit3.0 进行初步定量 Q-PCR对文库的有效浓度进行准确定量，至此文库构建结束。

建好的文库图？

illumina官网另外一张图

参考资料

https://www.fimm.fi/en/services/technology-centre/sequencing/next-generation-sequencing/dna-library-preparation

illumina官网

https://zhuanlan.zhihu.com/p/35278810